PCR反应准备工作要怎么做呢?

更新时间：2023-11-03

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PCR全称多聚酶链式反应（polymerase chain reaction），是一种非常强大的技术，可以通过一种非常简单但是高效的方法来复制DNA，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。那PCR反应准备工作要怎么做呢?
1.PCR反应体系

1.10×扩增缓冲液 10μl
2.4种dNTP混合物（终浓度）各100～250μmol/L
3.引物（终浓度）各5～20μmol/L
4.模板DNA 0.1～2μg
5.Taq DNA聚合酶 5～10 U
6.Mg2+（终浓度） 1～3mmol/L
7.补加双蒸水 100 μl

其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整，以上数据仅供大致参考值。
PCR反应五要素：

1.引物：(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。
2.酶：PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。
3.dNTP包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP
4.模板：模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。
5.缓冲液：（其中需要Mg2+）

缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：
缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；
一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；
二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；
辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。

2.PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则

1.引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
2.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
3.引物内部不应出现互补序列。
4.两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
5.引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有wan全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
6.引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，选择是G和C。
7.引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生wu素、荧光物质、di高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

3.模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、毛发等。

标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶jun酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、lv仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

4.反应的控制

1.PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子
2.镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L
3.底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L
4.TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
5.引物浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L
6.反应温度和循环次数

变性温度和时间 95℃，30s
退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）
Tm值=4(G+C) +2(A+T)

循环次数：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期"
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